‘新海16’愈伤组织诱导及白霜的优化

为获得高品质、活力旺盛且具有分化能力的愈伤组织,本研究在已建立的海岛棉(Gossypium barbadense)‘新海16’再生体系基础上,以MSB附加0.1 mg/L 2,4-D及0.1 mg/L KT为基本培养基,采用单因素随机试验研究外植体不同部位、光照及培养基成分等对‘新海16’愈伤组织诱导的影响。结果表明:‘新海16’愈伤诱导的外植体选用下胚轴中上部绿色茎段诱导效果较优;除此之外,愈伤诱导效果最佳的处理为2 000 lx光照强度、90%MSB无机盐成分、3 g/L PVP及1.2~1.4 g/L Gelrite或Phytagel,均能够降低愈伤组织出现白霜现象,对愈伤组织疏松生长有促进作用。本研究通过优化愈伤组织的诱导方法,提高胚性愈伤组织发生率,为‘新海16’高频再生体系提供科学依据。     

应用枇杷二代测序数据进行染色体步移研究

【目的】枇杷基因组数据尚未公布,限制了枇杷分子生物学的研究。当前很多研究集中在上游转录因子和下游基因启动子之间的调控关系上,所以获得目的基因的启动子显得尤为重要。传统方法使用PCR方式进行染色体步移来获得启动子区域,耗时且难出结果。【方法】对‘火炬’枇杷进行二代测序,二代测序为双端测序,片段含盖200到500bp的序列。根据下游基因序列通过测序片段来实现染色体步移。使用现有程序Magicblast和新开发的Promoter_Scan脚本程序来快速获取目的基因启动子区域。Promoter_Scan对每对Reads构建10 bp的索引序列,先使用索引匹配目的基因,匹配后使用目的基因前30 bp序列再次匹配目标Reads,最后完成拼接。【结果】通过二代测序共获得61.77 GB的‘火炬’枇杷基因组数据,测序深度约为85倍。使用Magicblast检索匹配Reads耗时长,难以二次开发,需要手动拼接延伸,每个基因启动子挖掘需要9.5 h。新开发Promoter_Scan脚本程序通过两次匹配,能够更快更准确地找到启动子序列。对枇杷中8个基因进行启动子查找,向上延长2 000 bp序列平均需要拼接11.7次,耗时21.3 min。根据步移后的序列设计引物进行验证,结果显示:Sanger测序结果和预测的序列高度一致。【结论】使用Magicblast检索方式能够达到实验要求,不需要编程技能,但是耗时长。Promoter_Scan能够实现自动延伸,显著缩短启动子挖掘时间。本研究中的两种方法不仅可以用于枇杷分子生物学的研究,对其他未公布基因组数据的物种同样适用。     

均腐土不同亚纲典型土系土壤细菌群落多样性研究

为研究中国土壤系统分类(CST)体系下均腐土不同亚纲土壤细菌群落结构的多样性，以 4个干润均腐土[富牧西系(DFm)、春雷南系(DCl)、保国系(DBg)、明水系(DMs)]和 4个湿润均腐土[大西江系(MDx)、新发北系(MXf)、卫星农场系(MWx)、裴德系(MPd)]的腐殖质层(Ah层)为研究对象，采用高通量测序技术研究细菌群落多样性，分析细菌群落结构与环境因子间的关系，以探讨影响均腐土不同亚纲群落结构的主要环境因子。结果表明:均腐土 8个土系样品共获得 1 674 634条基因序列，Shannon指数和 Chao1指数表现为:干润均腐土 >湿润均腐土。均腐土 8个土系细菌群落主要包括 10个门类，其中变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)为富牧西系、春雷南系、保国系、大西江系、新发北系、卫星农场系、裴德系优势菌门，明水系以绿湾菌门(Chloroflexi)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)为优势菌门；属水平上，均腐土各土系的群落差异较大。样品热图分析将 8个土系细菌群落聚为 2类，其中干润均腐土聚为一类，湿润均腐土聚为一类。pH、交换性 Ca、CEC、交换性 Mg、SOC和 TP是影响均腐土细菌群落结构发生变化的主要因子( P<0.05)。此外，RDA分析发现，土壤 pH为影响均腐土细菌群落结构的主导因子，而 pH、交换性 Ca、CEC为驱动干润均腐土细菌群落结构发生变化的主要影响因素，交换性 Mg、SOC、TP为驱动湿润均腐土细菌群落发生变化的主要影响因素。     

山羊卵泡发育相关基因的筛选及分析

【背景】山羊第一卵泡波中的优势卵泡（dominant follicles, DF）和从属卵泡（subordinate follicles, SF）是整个卵泡发育过程中最为关键的两个阶段。随着卵泡的进一步发育,最终DF可能发育成为成熟卵泡,直到排卵;SF将走向闭锁,其中颗粒细胞的凋亡是导致卵泡发生闭锁的关键因素。然而目前对促进卵泡的优势化或导致其闭锁的分子机理尚不清楚。【目的】通过对山羊第一卵泡波中DF和SF颗粒细胞进行高通量测序,旨在筛选影响卵泡发育的关键基因,为深入探究卵泡发育的调控机制提供理论依据。【方法】选取10只1岁龄健康的贵州白山羊分别注射前列腺素F_2α,使其同期发情,此后每天用B超检测并记录卵泡的生长情况,发情3 d后,统一屠宰并采集第一卵泡波中DF (直径4.5—6 mm)与SF (直径3 —4.5 mm),分别分离其中的颗粒细胞,提取总RNA、构建文库后通过Illumina Hiseq 2500平台进行测序。利用FastQC对测序产出raw reads进行质量评估并经过过滤后,获得品质较高的clean reads;使用Trinity对得到的clean reads进行重新组装,从而获得unigenes;使用CLC Genomics Workbench将unigenes与山羊RefSeq数据库进行比对获得mRNA;使用DESeq2 软件对获得的mRNA进行差异表达分析;分别采用goseq和kobas软件对得到的差异表达基因进行GO分析及KEGG信号通路分析;最终通过qRT-PCR对筛选出的可能影响卵泡发育的关键基因进行验证。【结果】分别对测序得到的raw reads进行过滤后,在DF颗粒细胞中获得43 217 934条clean reads,占raw reads的比例为95.19%;SF颗粒细胞中获得40 766 348条clean reads,占raw reads的比例为95.35%。将得到的unigenes与山羊的RefSeq 数据库进行比对后,共得到33 896条带有注释的转录本,再通过设定FPKM>1, q value<0.05,共在两种卵泡颗粒细胞中获得13 644个基因。设定参数：FPKM≥1,SF-FPKM/DF-FPKM>1,P<0.05,获得695个差异表达mRNA,其中233个在SF颗粒细胞中表达显著上调,462个表达显著下调;对所获得695个差异表达mRNA进行GO功能富集分析,共分为三大类42组：其中生物学过程占47.6%,细胞组分占47.6%,分子功能占4.8%;KEGG信号通路分析,发现20条通路,其中与核糖体通路相关的基因富集最为显著。通过在Genecard中进行功能分析后,筛选6个可能与山羊卵泡发育密切相关的基因,其中PRLR、PTX3、RGN在SF颗粒细胞中表现为上调;DKK3、ALDH1A2、RARRES1则表现为下调。qRT-PCR显示PRLR、RGN、DKK3、ALDH1A2、RARRES1的表达趋势与高通量测序结果一致,且RGN在从属卵泡颗粒细胞中的表达量极显著地高于优势卵泡（P<0.01）;DKK3、ALDH1A2、RARRES1在优势卵泡颗粒细胞中的表达量极显著地高于从属卵泡（P<0.01）。【结论】DKK3、ALDH1A2、RARRES1和RGN在优势卵泡和从属卵泡中表达量存在极显著差异,推测在山羊卵泡发育过程中可能促进卵泡的优势化或导致闭锁,对深入探究卵泡发育的调控机制具有重要意义。     

基于高通量测序的南泥湾湿地土壤细菌多样性分析

为研究南泥湾湿地细菌群落类群结构,本研究利用Illumina高通量测序技术,对土壤样品中细菌的16S rRNA基因进行测序分析。各样地共检测到细菌类群27门、106纲、163目、306科、534属,主要的优势菌门为变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、绿弯菌门(Chloroflexi)和酸杆菌门(Acidobacteria),主要的优势菌纲为α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、β-变形菌纲(Betaproteobacteria)和γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)。不同退化湿地土壤细菌的数量和种类各不相同。随着退化程度加深,土壤细菌群落多样性降低,南泥湾湿地土壤细菌菌种多样性在不同退化阶段的差异较大。通过典型对应分析发现,土壤p H值、有机质和全钾对南泥湾湿地土壤细菌分布影响较大。人为开垦活动会降低土壤微生物多样性,退耕还湿措施对湿地微生物群落结构有影响。     

番茄/茄子嫁接对其根际土壤生物学性状及细菌群落结构的影响

以茄子作为砧木，番茄为接穗进行嫁接，并以番茄自根植株和茄子自根植株作为对照，基于传统及现代高通量测序技术分析根际土壤的生物学性状及细菌群落结构特征，旨在揭示嫁接植株抗性增强的机制。结果表明：番茄/茄子嫁接植株根际土壤中可培养细菌、放线菌数量，微生物生物量、酶活性和细菌丰富度、多样性指数均显著高于茄子和番茄自根植株；另一方面，norank_c_Acidobacteria、硝化螺菌属（Nitrospira）、芽孢杆菌属（Bacillus）、norank_f_Gemmatimonadaceae、norank_o_Gaiellales、norank_f_Xanthobacteraceae、norank_o_SC-I-84、norank_f_Anaerolineaceae、norank_f_Nitrosomonadaceae、鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）细菌是嫁接植株与茄子、番茄自根植株根际土壤中的共有优势细菌属；g_unclassified_o_Ignavibacteriales 、 醋酸杆菌属（ g_Acetobacter ）、g_norank_f_Longimicrobiaceae 、g_unclassified_f_Verrucomicrobiaceae、g_norank_p_FBP、g_norank_p_Aminicenantes 属细菌是嫁接植株根际土壤的特有优势细菌属。与自根植株相比，番茄/茄子嫁接植株根际土壤存在更高可培养微生物数量，微生物生物量和相关酶活性，具有更高的土壤养分有效性，同时拥有不同占比的共有优势细菌门属，尤其拥有更为丰富的微生物可操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）和特有 OTU 数量，这是嫁接植株抗性增强的主要原因。     

苹果花脸病田间病情发展及ASSVd在组培条件下的传播

为了明确苹果锈果类病毒（apple scar skin viroid，ASSVd）引起的苹果花脸病在田间的病情发展情况以及ASSVd在组培条件下的传播方式，2012—2015年对河北省顺平南神南村3个果园进行持续调查和检测。结果显示，果园A、B、C的显症率分别从3.00%、19.35%和10.00%上升至10.00%、34.41%和22.00%，带毒率分别从11.00%、20.43%和14.00%上升至23.00%、37.63%和30.00%，带毒率和显症率都逐年增加，而且带毒率大于显症率，即有些带毒果树不显症。发病果树田间分布有明显的发病中心。通过高通量测序发现显症果树ASSVd vsiRNA reads数是带毒未显症reads数的4.08倍，同时实时荧光定量PCR检测发现显症树ASSVd病毒积累量显著高于带毒未显症树。以携带ASSVd的组培苗和无毒组培苗为试材，利用RT-PCR检测明确了ASSVd可通过伤口沾染带毒汁液、组培剪污染、含毒培养基、根系接触进行传播，其中根系接触传染率较高。     

H2S的信号分子作用及其对果蔬采后生理代谢的调控研究进展

硫化氢（H2S）作为气体信号分子，参与调控植物体的一系列生命活动，并在果蔬采后生理代谢过程中发挥着重要作用。本文综述了H2S的理化性质、发展应用历史及其在果蔬采后生理调控机制中的信号分子作用，讨论了H2S对果蔬生理代谢的调控作用，包括对果蔬采后抗逆性和品质的影响，以期为采后果蔬的贮藏保鲜提供理论参考。     

不同宿主源弓形虫ROP16基因的遗传变异分析

为研究不同分离株弓形虫棒状体蛋白ROP16基因的遗传变异，扩增9种不同来源的弓形虫样品的ROP16基因，并对其序列进行比对及构建进化树的分析。结果表明，弓形虫不同分离株ROP16序列的同源性均在990%以上，但存在限制性位点多态性；用弓形虫ROP16作为PCR-RFLP的标记分子，未能鉴别出传统的弓形虫Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型，却鉴定出一株特殊的猪源弓形虫分离株。弓形虫ROP16基因的株间保守性提示其是一个用于预防弓形虫病的潜在疫苗候选分子，值得对其进行深入研究。     

硅藻土吸附固定化Bacillus sp.DL-2胞内蛋白酶拆分制备(S)-乙酸苏合香酯

[目的](S)-乙酸苏合香酯是手性药物合成的关键手性砌块,其在多种手性化合物的合成及医药、香料的工业生产中具有重要的作用.传统的化学合成手性化合物的方法需要有毒有机溶剂及重金属的参与,对环境及人类具有严重的危害,同时得到的手性化合物的光学纯度较低.与传统的化学合成相比,酶法选择性拆分消旋体化合物,具有高立体专一性和区域选择性、副反应少、产率高、产物光学纯度好以及反应条件温和的优点,是一种被广泛认可的拆分方法.实验表明,Bacillus sp.DL-2胞内蛋白游离酶可拆分制备(S)-乙酸苏合香酯,然而游离酶不易回收且稳定性差,将Bacillus sp.DL-2胞内蛋白游离酶制备成固定化制剂,克服了游离酶对环境敏感,稳定性不高的缺点,为工业化生产(S)-乙酸苏合香酯奠定了基础.[方法]酶的固定化方法主要有物理吸附法、离子结合法、共价结合法、交联法和包埋法.以吸附法固定酶,酶的构象很少改变,因此,酶的催化活力损失较少;且吸附法固定化操作过程简单,因此吸附法在经济上是最具吸引力的固定化方法.硅藻土由硅藻的细胞壁沉积而成,硅藻土表面的多孔性与负电性使其呈现明显表面吸附性,因而被常用做吸附载体.以硅藻土作为固定化载体,对Bacillus sp.DL-2胞内蛋白酶进行固定化,用以拆分制备高光学纯的(S)-乙酸苏合香酯.利用单因素实验优化,确定制备固定化酶的最佳固定化条件及制备(S)-乙酸苏合香酯的最佳拆分条件,并测定了制备的固定化酶对金属离子的敏感度及储存稳定性.[结果]最佳固定化条件为:温度40℃,pH为7,固定化时间10 h,载体添加量100 g/L.在最佳固定化条件下制备了固定化酶,优化确定了制备(S)-乙酸苏合香酯的最佳拆分条件为:固定化酶用量为160 mg/mL,拆分时间7 h,拆分温度30℃,缓冲液pH为7.[结论]在最佳固定化及拆分条件下,制备的(S)-乙酸苏合香酯e.e.值可达到96.8％,转化率为73.9％,且固定化酶对金属离子敏感度较低,对反应环境要求较低,适用于工业化生产.固定化酶在4℃条件下储存,随保存周数的增加,e.e.值及转化率均逐渐降低,但4周后e.e.值仍能达到90.1％,转化率保持在66.6％左右,具备较高的储存稳定性,为工业化生产(S)-乙酸苏合香酯提供了参考.